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氢气对环卫工人雾霾暴露肺保护性作用的研究
中华结核和呼吸杂志 / 2017-04-21
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 来源:中华结核和呼吸杂志

近年来,环境细颗粒物(PM2.5)对人群健康的影响受到公众的广泛关注[1],大量的研究结果证实了PM2.5暴露对呼吸道的危害,但其机制尚未完全清楚。一般认为主要与其造成的氧化应激、炎性损伤、免疫毒性以及基因多态性等因素相关[2],其中氧化应激导致的肺损伤成为近年来研究的热点之一[3,4]

2007年Ohsawa等[5]首次报道氢气具有选择性抗氧化功能,随后,研究人员先后在肝脏、肾脏、心脏、脑以及糖尿病、肥胖、肿瘤等疾病动物模型中,发现氢气具有选择性抗氧化及抗炎能力[6]。近几年,随着氢气吸入治疗的实现,其对肺部疾病的影响才逐渐受到关注,基础研究已证实氢气在肺缺血再灌注、急性肺损伤、肺放射伤、肺移植等动物疾病模型中起保护作用[6],但其对呼吸系统的临床干预作用国内外尚未见报道。

环卫工人作为雾霾高暴露人群,PM2.5对其健康的影响迫切需要关注。本研究采取随机、双盲、对照的研究方法,探讨氢氧混合气吸入对暴露在雾霾环境下的环卫工人的肺保护作用。

对象与方法

1.受试对象:

2016年1—2月,选取石家庄市中心城区107名健康不吸烟环卫工人为研究对象,且确保试验期间每日暴露于室外4~6 h以上,连续暴露30 d。其中10名受试者因无法配合肺功能及呼出气一氧化氮(FeNO)检查而剔除。流失1名。有效受试对象共计96名,所有研究对象工作地点距研究中心2 km半径以内。根据入组先后顺序分组,奇数为试验组,偶数为对照组。试验组50名,男12名,女38名,年龄28~60岁,平均(47±7)岁,体重49.5~94.9 kg,平均(68±10)kg,身高146~178 cm,平均(162±7)cm;对照组46名,男10名,女36名,年龄35~60岁,平均(47±6)岁,体重47.0~105.8 kg,平均(66±11)kg,身高146~176 cm,平均(162±7)cm。两组性别、年龄、身高及体重差异无统计学意义(均P>0.05)。本研究经河北医科大学第二医院伦理委员会审核通过(批号:2016002),同时所有受试者入组前均签署知情同意书。

2.治疗方法:

试验组吸入氢氧混合气(67%/33%,氢/氧气雾化机由上海潓美医疗科技有限公司生产),对照组给予吸入氮氧混合气(67%/33%,氧气雾化机由上海欧亮医疗器械有限公司生产),1次/d,1 h/次,两组受试对象据不同班次均选择工作后进行治疗,为期30 d。

3.问卷调查:

据课题组自制表格统一调查人口学资料、每天户外工作时间、自觉症状以及干预治疗后不良反应等。试验结束后30 d电话随访上述情况。试验前调查人员统一培训,两人一组逐一完成调查。

4.FeNO测定:

采用无锡尚沃生物科技有限公司生产的纳库仑呼气分析仪(P100A,序列号svp003141107050),所有观察对象分别于试验前1天(第0天),第8、15、30天进行FeNO测定。

5.肺功能检测:

采用日本CHEST公司生产的HI-801肺功能仪,2名操作测定人员均经专业培训,按ATS推荐的测试程序测定,选择用力肺活量(FVC)、第一秒用力肺活量(FEV1)、最大呼气中期流速(MMEF)、最大呼气流速(PEFR)、一秒率(FEV1/FVC%)共计5项通气功能指标,采用各指标实测值占预计值的百分比用于统计分析。

6.细胞因子及氧化应激相关产物:

所有观察对象分别于试验第0、8、15、30天采集静脉血及超声雾化诱导痰液。应用静脉采血针采取静脉血于凝胶真空采血管中(≥3 ml),至15 ml离心管中3 000 r/min离心,离心半径13.5 cm,低温离心10 min,将上清液分装到EP管中;清水漱口后,以梯度浓度法(1.8%,2.7%)进行高渗盐水雾化诱痰,整个诱痰过程中痰杯要放在冰袋上,重复该过程直至收集足够痰液(≥3 ml)。加入3倍体积的10 g/L二硫苏糖醇,震荡混匀,置于37 ℃水浴中震荡10 min,涡旋5 min后,经48 μm的尼龙筛网过滤至15 ml离心管中2 000 r/min离心,离心半径13.5 cm,低温离心10 min,将上清液分装到EP管中,每管1.5 ml。采集完成后血清及痰液上清液均于-80 ℃冰箱冻存。除丙二醛(南京建成科技有限公司,China)采用TBA法外,IL-2、IL-10、转化生长因子(TGF)-β1 (加拿大Anogen公司)、人胞外超氧化物歧化酶3(SOD3,韩国AbFrontier公司)、基质金属蛋白酶12(MMP-12,美国AnaSpec公司)、C反应蛋白(CRP,德国LDN公司)采用ELISA双抗夹心法测定。所有样本检测在上海Bio TNT生物科技有限公司完成,所有操作完全由实验员按照试剂盒说明书进行。

7.统计学处理:

原始数据的整理及录入由两名研究人员共同完成,一般调查资料、肺功能及FeNO数值录入SAS 9.4,人口学资料如年龄、身高、体重采用±s描述。肺功能及FeNO采用协方差分析校正初始指标后分析处理因素的影响。细胞因子及氧化应激产物录入SPSS 21.0系统,由于个体差异大,采用重复测量值与基线值比值进行Wilcoxon符号秩检验,因子水平采用比值中位数(P25P75)进行一般的描述性分析。主观症状改善情况组间比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.大气颗粒物:

所有PM2.5数据均来源于河北省石家庄市环保局提供的受试对象工作地监测点当日空气质量平均值。在"GB3095-2012环境空气质量标准"中规定PM2.5≥75 μg/m3判定为雾霾日。试验期间PM2.5平均污染浓度为82.4 μg/m3,其中雾霾天数达到11 d(36.7%),主要集中在研究前期(64%),PM2.5污染水平波动情况见图1

图1

2016年1-2月石家庄市PM2.5监测日均值

2.FeNO:

试验前后两组FeNO检测水平见表1。第8天试验组FeNO测定值为(16±5)×109,明显低于对照组的(21±14)×109(F=6.94,P<0.05)。

表1

两组对象呼出气一氧化氮协方差分析比较(±s,×109)

3.肺功能:

治疗前两组对象肺功能各项指标基线水平差异无统计学意义(均P>0.05)。第8天试验组FEV1占预计值%为(96±13)%,高于对照组的(94±14)%(F=3.96,P<0.05);第30天试验组FEV1占预计值%为(97±14)%,高于对照组的(95±12)%(F=8.5,P<0.05);第15天试验组PEF占预计值%为(73±15)%,高于对照组的(67±18)%(F=8.68,P<0.05);各项指标重复测量值与基线值比值作图如图2所示。

图2

两组肺功能重复测量值与基线值比值的比较(aP<0.05)

4.炎性因子与氧化应激产物:

(1)痰上清液:第8天,试验组的MMP-12(t=1 434,P<0.05)和SOD3(t=1 433.5,P<0.05)低于对照组;第15天,试验组的IL-10高于对照组(t=2 065,P<0.01),SOD3差异性增大(t=1 349,P<0.01);第30天,除MMP-12、SOD3和IL-10外,试验组的IL-2(t=1 200.5,P<0.01)、丙二醛(t=1 437.5,P<0.05)低于对照组,以上各指标结果如表2图3所示。TGF-β1和CRP治疗期间各观察点差异无统计学意义(均P>0.05)。(2)血清:吸氢治疗第8天,血清中IL-2(t=1 432,P<0.05)、IL-10(t=1 957,P<0.01)、SOD3(t=1 227,P<0.01)有变化。试验组IL-2[1.00(0.80,1.00)]低于对照组[1.00(1.00,1.38)],试验组SOD3低于对照组,试验组IL-10高于对照组(均P<0.05);第15天,以上3种指标差异性仍存在,IL-2差异较第8天增大(t=1 309,P<0.01),试验组比值为0.83(0.72,1.00),对照组为1.00(1.00,1.35);除上述3个指标差异外,第30天试验组的MMP-12低于对照组(t=1 214.5,P<0.01),见表3图4。TGF-β1、丙二醛及CRP在各观测点比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表2

两组痰液细胞因子与氧化应激产物各观察点比值比较[中位数(P25P75)]

表3

两组血清中细胞因子与氧化应激产物各观察点比值比较[中位数(P25P75)]

图3

痰上清液细胞因子及氧化应激产物重复测量值与基线值比值的比较(aP<0.05,bP<0.01)

图4

血清中细胞因子及氧化应激产物重复测量值与基线值比值的比较(aP<0.05,bP<0.01)

5.主观症状:

试验前受试者自觉呼吸道症状试验组(31名)及对照组(33名)比较差异无统计学意义(P>0.05),试验组研究结束后30 d电话随访显示试验组呼吸系统症状改善率达83.87%,高于对照组的51.52%(χ2=7.59,P=0.005 9)。

讨论

随着咳嗽、胸闷等雾霾暴露相关症状的增加,PM2.5对呼吸道的危害日益受到关注,现有研究结果表明,PM2.5主要通过炎性及氧化损伤对呼吸道造成危害。但对于雾霾造成的损伤,除了减少暴露等防护措施外,目前尚无有效防治方法,这对于某些无法避免雾霾暴露的人群存在巨大潜在危害。而氢气因其选择性抗氧化、抗凋亡及抗炎症的生物学特性,使部分学者将目光投向了该气体,但氢气对于肺脏疾病的影响尚处在动物实验阶段,尚未得到临床数据支持。环卫工人作为无法避免雾霾暴露的人群,呼吸系统受到可吸入颗粒物的危害较严重。本研究选取污染较重的石家庄市中心城区环卫工人为研究对象,采用RCT的研究方法,探讨氢气吸入对于雾霾暴露所致氧化及炎性损伤的保护作用,初步显示了其有效性。

FeNO被认为是呼吸道变态反应的一种非侵袭性生物标志物[7]。有文献报道,空气污染与老年支气管哮喘(哮喘)患者、健康成年人[8] 以及学龄儿童[9]的FeNO水平相关,Flamant-Hulin等[10]也发现暴露在PM2.5条件下的哮喘和非哮喘儿童的FeNO水平明显上升,说明空气污染影响FeNO水平。基于以上研究,我们监测了氢气对雾霾暴露人群FeNO水平的影响。结果显示,在第8天,对照组FeNO水平明显高于试验组,但在试验中后期,该差异消失,两组FeNO水平又回落至基线水平。分析其原因可能与试验期间雾霾浓度波动较大有关,由于一氧化氮在体内浓度较低,半衰期短且极易被氧化,前期空气污染重,中后期石家庄市区空气质量得到短时改善,颗粒物吸入浓度降低,导致差异性不显著,同时也不能除外气道上皮细胞对于颗粒物刺激的适应性导致差异性消失,这需要进一步扩大研究规模,采用时间序列动态分析其可能性。国外研究结果也证实,把居住在高污染城市环境下的哮喘儿童转移至农村后,测定FeNO水平明显下降[11],与本研究后期FeNO差异消失的结果相符。因此,试验组第8天FeNO低于对照组仍可推断其在某种程度上降低了雾霾气道致炎作用,机制可能包括氢气阻遏氧化应激产物生成,降低一氧化氮合成酶(iNOS)诱导生成,使气道上皮细胞产生一氧化氮减少。

肺功能是反映肺和呼吸道功能状态的重要指标,短时或长期雾霾暴露会影响肺功能[12,13]。文献报道,长期暴露在PM2.5环境下,PM2.5升高2 μg/m3,FEV1下降13.5 ml,并且下降速度每年增加2.1 ml,FVC也有相似的变化[12]。国内一项对于雾霾高暴露人群(交通警察)的研究结果显示,在路口执勤交警的FEV1及PEF水平显著低于疾控中心工作人员[14]。本研究结果显示,两组FEV1及PEF出现差异,但试验期间结果不稳定。虽然较多文献报道雾霾对于肺功能的损伤作用,国内基础研究也证实氢气吸入治疗可有效抑制卵清白蛋白激发引起的气道阻力升高[15],但本研究只显示第8、30天FEV1两组有差异,第15天PEF存在显著性差异,对照组两指标波动于基线水平。这些结果尚难得出氢气吸入改善肺功能的结论,需进一步研究证实。

PM2.5暴露可刺激单核/巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和内皮细胞,诱导炎症细胞抑制或促进多种细胞因子的表达与释放。IL-2主要由活化的CD4和CD8 T淋巴细胞产生,PM2.5 进入肺泡后,正常表面活性物质吸附在其表面,与其产生交互作用,可能破坏正常表面活性物质的物理性质和免疫功能,使得淋巴细胞受到免疫损伤,前炎性细胞因子IL-2释放。但也有研究证实IL-2释放过程还可能与钙稳态失衡相关,交通相关的PM2.5通过钙信号通路可能参与调控PM2.5对Jurkat T细胞IL-2的释放[16],由此可见,PM2.5可能通过不同途径刺激IL-2的释放。抑炎因子IL-10几乎能抑制所有促炎症性细胞因子的合成与释放(如TNF-α、IL-2、IL-6、IL-12等),研究结果表明,小鼠气管内滴注PM2.5染毒后,IL-10随着染毒剂量的增加而增加[17]。临床研究结果表明,暴露于高浓度PM2.5的交通警察,血液中超敏CRP水平增加[18]。我们前期研究结果也显示交通警察与环卫工人短时重度雾霾暴露后痰上清液中一些炎症因子增加,但研究结果尚在整理中。本研究中第8天试验组血清中IL-2高于对照组,痰液中IL-2的变化滞后于血清,治疗30 d开始出现差异。同样,血清中抑炎因子IL-10在治疗第8天升高,痰液中第15天升高。痰液及血清中CRP水平两组各观察点均无明显差异。从分子水平上分析,PM2.5诱导产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)作为信号分子可以激活Nrf2/ARE信号通路,也可以诱导激活核转录因子NF-κB[19]。动物研究结果表明,氢气可参与多种肺部疾病保护作用的分子信号通路,吸入氢气可以直接或间接激活Nrf2通路,活化其下游分子进而抑制炎症反应[20],氢也通过作用于经典的NF-κB通路减少小鼠哮喘模型中BALF的炎症因子水平[21]。由此可见,吸氢治疗可能对抗雾霾所致损伤的不同分子通路,导致炎症因子血清及痰液变化时间上的不一致性,也可能由于氢气组织穿透力极强,首先引起血液炎症系统发生变化,然后影响到呼吸道,但尚无基础研究支持。

PM2.5除自身带有ROS成分外,还能刺激细胞产生大量ROS,造成细胞氧化损伤。ROS主要分为两大类,一类是毒性自由基,如羟自由基(·OH)、亚硝酸阴离子(ONOO),另一类是功能自由基,如一氧化氮(·NO)、超氧阴离子(O2·)、过氧化氢(H2O2)。细胞水平研究结果表明,氢气可以选择性中和低浓度毒性活性氧自由基,如·OH、ONOO[5]。丙二醛含量是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数,SOD3是主要的抗氧化金属酶,具有清除体内自由基的作用,以上两种因子均为活性氧清除剂,可分解机体代谢过程中产生的活性氧,其水平高低亦反映了机体的抗氧化能力,当机体自由基产生大幅过多激增时,细胞或机体会诱导性地增强抗氧化能力。研究结果表明,抗氧化剂能够阻断、清除、中和自由基和生理条件下产生的大量活化中间产物,减轻由PM2.5 造成的炎症反应[22]。本研究结果显示,试验组痰液及血清中SOD3在治疗第8、15天及结束时均低于对照组,痰液中丙二醛第30天比较试验组低于对照组。由此可见,吸入氢气能够降低雾霾所致机体氧化应激产物水平,维持机体氧化/抗氧化系统平衡,降低气道氧化损伤。

长期暴露于PM2.5环境下,还可以引起气道及肺泡损伤、修复、重塑。TGF-β信号转导通路上的TGF-β1受体的激活与肺纤维化的发生密切相关[23],而ROS可以通过激活TGF-β经典的下游信号转导通路Smad通路,从而促进纤维化的发生。基质金属蛋白酶12(MMP-12)也被称为人巨噬细胞弹性蛋白酶,其异常增多可破坏弹性纤维蛋白,引起最大气流减少,从而导致肺气肿[24]。以上两种因子均参与纤维损伤与修复过程,是长期雾霾暴露所致不完全可逆损伤的分子基础。本研究结果显示,痰液中MMP-12在第8、15及30天均表现出差异,血清中MMP-12在第30天出现差异,提示氢气可能对雾霾所致肺弹性纤维损伤相关炎症反应有抑制作用,有望阻断PM2.5所致肺气肿的发生,降低发病率。TGF-β1在各观察点未见差异,推测短期颗粒物吸入与肺纤维化的发生尚无关联。

试验结束后30 d随访结果显示,环卫工人原有咳嗽等呼吸系统症状得到明显改善。但由于取样次数的限制及雾霾暴露水平的影响,本试验尚存在诸多不足,有待于进一步扩大临床研究。但本研究突破了国内外氢气对于肺脏疾病的动物实验阶段,首次应用于人类。

总之,氢气吸入治疗有助于降低气道氧化应激损伤相关炎性水平,对全身炎症反应可能也有一定抑制效果,同时能够改善环卫工人咳嗽等呼吸系统症状。随着氢气分子作用机制研究的不断深入及使用安全顾虑解除,氢气治疗有望成为一种有效的临床干预措施,造福于大气污染暴露及肺部疾病患者。

 

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